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  • 专利说明
  • 权利要求
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  • 同族专利
  • 引用文献
  • 法律状态
  • 优先权
    • 专利摘要:
    Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur enzymatischen Herstellung von Baccatin III in einem Enzymreaktor (R), wobei der Enzymreaktor (R) eine Hohlfaser-Ultrafiltrationsmembran (M) aufweist, wobei im Innern des Enzymreaktors (R) eine Acetyltransferase aus Taxus spec. immobilisiert ist. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Baccatin III aus 10-Deacetylbaccatin III (10-DAB) in einem Enzymreaktor (R), wobei das 10-DAB in einem Flüssigphasensystem, bestehend aus einer wässrigen Phase (A) und einer organischen Phase (B) mittels eines eine Acetyltransferase aus Taxus spec. enthaltenden Zellrohsafts zu Baccatin III umgesetzt wird. Dadurch wird es möglich, Baccatin III herzustellen, ohne dass aufwendige Reinigungsschritte der Acetyltransferase notwendig sind. Auch die Aufreinigung des Baccatin III wird deutlich erleichtert.
    公开号:DE102004002259A1
    申请号:DE200410002259
    申请日:2004-01-09
    公开日:2005-08-04
    发明作者:Dieter Dr. Frense；Gerald Prof. Dr. Lauckner；Doreen Lisicki；Christian Pflieger
    申请人:INST BIOPROZESS ANALYSENMESST；Institut fur Bioprozess- und Analysenmesstechnik eV；
    IPC主号:B01D61-14
    专利说明:
    [0001] DieErfindung betrifft eine Vorrichtung zur enzymatischen Herstellungvon Baccatin III gemäß dem Oberbegriffdes Anspruchs 1, sowie ein Verfahren zur enzymatischen Herstellungvon Baccatin III gemäß dem Oberbegriffdes Anspruchs 5.
    [0002] Taxane,insbesondere Paclitaxel (Taxol) sind zytotoxische Diterpene ausder Eibe, von denen einige die Zellreplikation hemmen. Dies geschiehtdadurch, dass die Taxane, speziell Paclitaxel, an die Tubulinpolymerebinden und diese stabilisieren, so dass die dynamische Reorganisationdes mikrotubulärenSystems blockiert wird. Somit wird die Zellteilung in der G2/M-Phasedes Zellzyklus inhibiert. Aufgrund diese Mechanismus haben Taxaneeine Antitumorwirkung und werden zunehmend gegen eine Reihe vonKarzinomen, insbesondere Ovarial-, Mamma- und Bronchialkarzinomeeingesetzt.
    [0003] Wegender Antitumorwirkung von Paclitaxel besteht ein großer Bedarfan dieser Substanz. Viele Behandlungen können nicht oder nur unzureichend durchgeführt werden,da Paclitaxel lediglich in geringen Mengen und zu hohen Kosten zurVerfügunggestellt werden kann.
    [0004] ZurZeit wird die Herstellung von Paclitaxel insbesondere auf die Aufarbeitungder Rinde von Taxus brevifolia (Nutt.) gestützt. Da die Konzentration vonPaclitaxel in der Rinde jedoch sehr niedrig ist, könnte diesesVerfahren absehbar zur Zerstörung desEibenbestandes führen.Daher müssen ökologischund ökonomischsinnvolle Alternativen in Form einer chemischen Synthese entwickeltwerden.
    [0005] Daeine Vollsynthese von Paclitaxel aufgrund ihrer geringen Ausbeutennicht in Frage kommt, kann eine Semisynthese auf der Grundlage von10-Deacetyl-baccatin III (10-DAB) erfolgen.
    [0006] Außerdem kann10-DAB kann in signifikanten Mengen aus den Nadeln und Zweigen vonEiben gewonnen werden. Da dieses Ausgangsmaterial in großen Mengenin der Park- und Forstwirtschaft anfällt und der Eibenverschnittsowieso schwer zu entsorgenden ist, stellt sich hierbei nicht dasoben geschilderte Problem der Bestandsgefährdung der Eibe. Auch unterKostenaspekten ist diese Quelle zu bevorzugen.
    [0007] Beider Semisynthese von Baccatin III muss 10-DAB an Position 10 stereospezifischacetyliert werden (siehe dazu 3).Es ist bekannt, dass diese Reaktion von Acetylasen katalysiert werdenkann.
    [0008] Die DE 198 22 881 A beschreibtein Verfahren, bei dem 10-DAB mittels einer gereinigten Acetyltransferaseaus Taxus baccata unter Beigabe von Acetyl-Coenzym A zu BaccatinIII umgesetzt wird.
    [0009] Jedochsind eine Reihe von Aspekten des Verfahrens gemäß der DE 198 22 881 A als nachteiliganzusehen: So muss die verwendete Acetyltransferase aus Taxus spec.zunächstgereinigt werden. Die Umsetzung muss zudem unter Beigabe eines Acetyl-Coenzym A regenerierendenSystems erfolgen, da das Acetyl-CoenzymA bei der Umsetzung zu Baccatin III verbraucht wird. Auch werdenbei diesem Verfahren halogenierte organische Lösungsmittel, wie ein Chloroform-Heptan-Gemisch,eingesetzt.
    [0010] Esist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung Baccatin III als Vorstufedes Paclitaxels, ohne die oben genannten Nachteile herzustellen.
    [0011] DieseAufgabe wird durch die Vorrichtung gemäß Anspruch 1 gelöst.
    [0012] Erfindungsgemäß wird eineVorrichtung zur enzymatischen Herstellung von semisynthetischen Taxen,insbesondere Baccatin III, in einem Enzymreaktor bereitgestellt,wobei der Enzymreaktor eine Hohlfaser-Ultrafiltrationsmembran aufweist,wobei im Innern des Enzymreaktors eine Acetyltransferase aus Taxusspec. immobilisiert ist.
    [0013] Hohlfaser-Ultrafiltrationsmembranenzeichnen sich durch eine Vielzahl von Kapillarmembranen aus, sodass das VerhältnisOberflächezu Volumen sehr hoch ist, wobei gleichzeitig eine kompakte Bauweiseerreicht werden kann. Somit kann eine hohe Umsatzrate erzielt werden.
    [0014] UnterImmobilisierung ist hier zu verstehen, dass die Acetyltransferaseaus Taxus spec. sich in einem abgeschlossenen Kompartiment bzw.Kreislauf befindet. Die Acetyltransferase befindet sich, wie untennoch erläutertwerden wird, in einer wässrigen Phaseinnerhalb dieses auch als Reaktionsraum dienenden geschlossenenKompartiments bzw. Kreislaufs und wird in der wässrigen Phase laufend umgewälzt.
    [0015] Durchdie Immobilisierung einer Acetyltransferase ergibt sich für die Synthesevon Baccatin III eine verkürzteReaktionszeit.
    [0016] DieAcetyltransferase aus Taxus spec. katalysiert die Über tragungeiner Acetylgruppe auf die OH-Gruppe an Position 10 des 10-DAB,wodurch Baccatin III entsteht. Sie wird durch die Immobilisierungin konzentrierter Form bereitgestellt.
    [0017] Ineiner vorteilhaften Ausführungsformder erfindungsgemäßen Vorrichtungweist die Hohlfaser-Ultrafiltrationsmembran Polysulfon und/oderPolyethersulfon auf, bzw. besteht aus Polysulfon und/oder Polyethersulfon.Insbesondere weist die Hohlfaser-Ultrafiltrationsmembran Polypropylenfasernauf, die mit Polypropylen-Glycol PPG-4000 oder Polybutylen-GlycolPBG-4800 oder flüssigenPolymeren imprägniertwurden. Aber auch Polyethersulfonmembranen der Hohlfaser-Ultrafiltratonsmembrankönnenmit flüssigenPolymeren imprägiertsein.
    [0018] Weiterhinist es von Vorteil, dass die Hohlfaser-Ultrafiltrationsmembran eine Porengrößenverteilungvon kleiner 10 nm oder Trenngrenze von kleiner 50 Kilodalton (kD)aufweist. von besonderem Vorteil ist eine Porengrößenverteilungvon kleiner/gleich 3 nm oder eine Trenngrenze von kleiner/gleich10 kD.
    [0019] Weiterhinwird die Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 5 gelöst.
    [0020] Beidem erfindungsgemäßen Verfahrenzur enzymatischen Herstellung von semisynthetischen Taxanen wiez.B. Baccatin III, insbesondere in einem Enzymreaktor, wird 10-DABmittels eines eine Acetyltransferase aus Taxus spec. enthaltendenZellrohsafts in einem Flüssigphasensystem,insbesondere einem Zweiphasensystem, bestehend aus einer flüssigen wässrigenPhase und einer flüssigenorganischen Phase zu Baccatin III umgesetzt.
    [0021] VonVorteil bei diesem Verfahren ist es, dass ein Zellrohsaft zum Einsatzkommen kann, und keine aufwendigen Aufreinigungsschritte vor demEinsatz der Acetyltransferase in der Synthese durchgeführt werdenmüssen.Außerdemwerden mit dem Zellrohsaft weitere Enzyme bereitgestellt.
    [0022] DerZellrohsaft wird wie folgt gewonnen: Suspension von geeigneten Zellenin einem wässrigenPuffer, insbesondere Phosphatpuffer; Zellaufschluss, insbesonderemittels Ultraschall unter Zugabe einer DNase; Abzentrifugation;Fällungdes Überstandesmit einer Polyethylenimin-Lösung;Abzentrifugation; Versetzen des Überstandesmit Glycerin.
    [0023] Durchdie Verwendung der Acetyltransferase aus Taxus spec. erfolgt dieHerstellung von Baccatin III, wobei dieses Baccatin III praktischenantiomerenrein vorliegt, da die Acetyltransferase eine stereospezifischeAcetylierung an Position 10 des 10-DAB katalysiert.
    [0024] AlsflüssigewässrigePhase wird vorteilhafter Weise ein wässriger Puffer, insbesondereein Phosphat- und/oder MOPS-puffereingesetzt. Als organische Phase wird bevorzugt ein nicht-halogenierterEther, insbesondere Diisopropylether oder Dibutylether eingesetzt.
    [0025] Diisopropyletherund Dibutylether sind von Vorteil, da das synthetisierte BaccatinIII in diesen organischen Lösungsmittelnselektiv löslichist und somit direkt nach der Synthese aus der wässrigen Phase extrahiert wird,währenddas Substrat praktisch vollständigin der organischen Phase verbleibt.
    [0026] Weiterhinsind Diisopropylether und Dibutylether gegenüber nicht-halogenierten Lösungsmitteln in ökologischerHinsicht vorteilhaft.
    [0027] Ineiner vorteilhaften Ausführungsformdes erfindungsgemäßen Verfahrenswird die in dem Zellrohsaft befindliche Acetyltransferase im Enzymreaktorin der wässrigenPhase (A) immobilisiert, und zwar insbesondere durch eine Hohlfaser-Ultrafiltrationsmembran,wobei diese Ultrafiltrationsmembran vorteilhafterweise hydrophobist. Die Hydrophobizität wirdinsbesondere dadurch erreicht, dass die UltrafiltrationsmembranPolysulfon und/oder Polyethersulfon aufweist bzw. aus Polysulfonund/oder Polyethersulfon besteht.
    [0028] Durchdie Immobilisierung wird die Acetyltransferase nicht durch den Flussdes Zellrohsaftes durch den Enzymreaktor ausgeschwemmt, sondern verbleibtin der wässrigenPhase. Dies gewährleistet hoheUmsatzraten des Enzyms.
    [0029] Ineiner besonders vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens weistdie Hohlfaser-Ultrafiltrationsmembran eine Porengrößenverteilungvon kleiner 10 nm oder eine Trenngrenze von kleiner 50 kD auf. Besondersbevorzugt ist eine Porengrößenverteilungvon kleiner/gleich 3 nm oder eine Trenngrenze von kleiner/gleich10 kD.
    [0030] DieHohlfaser-Ultrafiltrationsmembran trennt vorteilhafter Weise dieorganische von der wässrigen Phase,liegt also zwischen diesen beiden Phasen.
    [0031] Dieerfindungsgemäße Synthesevon Baccatin III erfolgt enzymatisch, wobei ein Coenzym notwendigist, nämlichAcetyl-Coenzym A(Acetyl-CoA) (siehe dazu auch 3). Darausfolgt, dass eine Regenerierung des Acetyl-Co A erforderlich ist,um einen fortlaufenden Syntheseprozess zu gewährleisten.
    [0032] Demgemäß wird ineiner vorteilhaften Ausführungsformdes erfindungsgemäßen Verfahrens derwässrigenPhase zur Regenerierung des durch die Umsetzung von 10-DAB zu BaccatinIII verbrauchten Acetyl-Coenzyms A der wässrigen Phase Glucose und/oderPyruvat zugesetzt.
    [0033] Dereingesetzte Zellrohsaft verfügt über die benötigten Enzyme,um aus Glucose und/oder Pyruvat das bei der Umsetzung von BaccatinIII anfallende Coenzym A zu acetylieren und somit zu regenerieren.Dadurch wird eine kontinuierliche Umsetzung von 10-DAB zu BaccatinIII im Enzymreaktor ermöglicht.
    [0034] Besondersvorteilhaft ist es in diesem Zusammenhang, wenn der Zellrohsaftaus Escherichia coli oder der Hefe Pichia pastoris oder aus Spalthefengewonnen wird, da sich diese Organismen gut für die Expression heterologerProteine in großenAusbeuten eignen. Dafürkönnendiese Organismen nach Einbringung geeigneter Plasmide zur Proteinexpression,die fürdie Acetyltransferase aus Taxus spec. kodieren, zur Herstellungdes Zellrohsaftes hergestellt werden. Die Verfahren zur Überexpressionvon heterologen Proteinen sind dem Fachmann bekannt.
    [0035] ZurHerstellung des Zellrohsaftes kann der durch Aufschluss der Zellengewonnenen Zellsaft durch Zugabe von mindestens einer Nuklease,insbesondere einer DNase, von Nukleinsäuren befreit werden.
    [0036] Vordem Einfüllenin den Enzymreaktor wird der Zellrohsaft vorteilhafterweise durchFällungmit einer Polyethylenimin-Lösung hergestellt,wobei ggf. Glycerin zur Stabilisierung verwendet werden kann. Dadurchwerden insbesondere fürdas Verfahren nicht benötigteProteine abgetrennt.
    [0037] Ineiner weiteren vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens gehtdie Herstellung von der Substanz 10-Deacetyl-baccatin III (10-DAB) aus. Das 10-DABwird insbesondere aus Eibennadeln gewonnen. Dies ist insbesondereunter ökologischen Gesichtspunktenvorteilhaft, da somit der Eibenbestand geschont werden kann.
    [0038] Dievorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Figuren näher beschrieben.Darin zeigt:
    [0039] 1A dieStrukturformel von 10-DAB;
    [0040] 1B dieStrukturformel von Baccatin III;
    [0041] 2 einFließbilddes Enzymreaktors; und
    [0042] 3 dieim Enzymreaktor ablaufende Umsetzung von 10-DAB in Baccatin IIIund die Regenerierung von Acetyl-Coenzym A.
    [0043] 1A zeigtdie Strukturformel von 10-DAB. An der polyzyklischen Ringstrukturbefinden sich vier OH-Gruppen an den Positionen 1, 7, 10 und 13,die alle das Ziel einer Acetylierung werden können. Durch die Verwendungeiner Acetyltransferase aus Taxus spec., die spezifisch die OH-Gruppean Position 10 acetyliert, wird erreicht, dass Acetylierungen an anderenPositionen vermieden werden.
    [0044] 1B zeigtdie Strukturformel von Baccatin III, das durch Acetylierung vondem in 1A gezeigtem 10-DAB in Position10 erhalten wird.
    [0045] In 2 istder Enzymreaktor R in einem Fließbild dargestellt. Der Behälter B0,in dem die Umsetzung von 10-DAB zu Baccatin III erfolgt, weist mindestenseine Hohlfaser-Ultrafiltrationsmembran auf.Zwei KreisläufeK1, K2 sind an den BehälterB0 angeschlossen.
    [0046] Ineinem ersten Kreislauf K1 zirkuliert die organische Phase, alsomindestens ein nicht-halogenierter Ether, insbesondere Diisopropylether und/oderDibutylether. Die Stömungsrichtungist durch einen Pfeil angegeben. Innerhalb des ersten KreislaufsK1 sind ein BehälterB1 als Vorratsbehälter,sowie der Drucksensor D1 am Übergangvom BehälterB0 in die Rohrleitung und der Drucksensor D2 am Übergang von der Rohrleitungin den BehälterB0 angeordnet. Die Zirkulation der organischen Phase wird durcheine motorbetriebene Pumpe P1 gewährleistet.
    [0047] Ineinem zweiten Kreislauf K2 zirkuliert die wässrige Phase, also der Zellrohsaft.Die Stömungsrichtungist auch hier durch einen Pfeil angegeben. Zur Verbesserung desExtraktionsverhaltens kann die Strömungsrichtung jedoch auch umgekehrtwerden, womit die Extraktion im Gegenstromverfahren verläuft. Innerhalbdes zweiten Kreislaufs K2 sind ebenfalls ein Behälter B2 als Vorratsbehälter, sowie derDrucksensor D3 am Übergangvom BehälterB0 in die Rohrleitung und der Drucksensor D4 am Übergang von der Rohrleitungin den BehälterB0 angeordnet. Der BehälterB2 weist Mittel zur Temperatur- und pH-Messung auf. Zwischen demDrucksensor D3 und dem BehälterB2 ist zudem ein Regulierventil V zur Regulation des Druckgradientenin der in dem zweiten Kreislauf K2 zirkulierenden wässrigenPhase angeordnet. Die Zirkulation der organischen Phase wird durcheine motorbetriebene Pumpe P2 gewährleistet.
    [0048] EineAuffangwanne A dient dem Auffangen von Flüssigkeit im Falle eines Lecks.Ein im Enzymreaktor R angeordnetes Heizmittel H dient der Einstellungeiner geeigneten Temperatur.
    [0049] Mittelsder Pumpen P1, P2 werden die organische und die wässrige Phaseständigim Kreis umgewälzt,so dass zum einen ständigneues Substrat in den Reaktionsraum im Behälter B0 geführt wird, andererseits dasim Reaktionsraum gebildete Produkt ständig entfernt wird.
    [0050] 3 zeigtdie im Enzymreaktor ablaufende Umsetzung von 10-DAB in BaccatinIII und die Regenerierung von Acetyl-Coenzym A. Die in der Mitte der Abbildunggezeigte Hohlfaser-Ultrafiltrationsmembran (M) trennt die auf derlinken Seite gezeigte wässrigePhase (A) von der auf der rechten Seite gezeigten organischen Phase(B). Die wässrigePhase (A) besteht bevorzugt aus Phosphatpuffer und/oder MOPS-Puffer, die organischePhase (B) weist bevorzugt nicht-halogenierteLösungsmittel,insbesondere Diisopropylether oder Dibutylether auf.
    [0051] Inder wässrigenPhase (A) findet die von der Acetyltransferase katalysierte Umsetzungvon 10-DAB zu Baccatin III statt, wobei Acetyl-Coenzym A (Acetyl-CoA)unter Übertragungder Acetylgruppe an Position 10 des 10-DAB zu Coenzym A umgesetzt wird.Dabei ist die Acetyltransferase in der wässrigen Phase immobilisiert,so dass sie wiederholt zur Umsetzung des im Enzymreaktor befindlichen10-DAB zur Verfügung steht.Das Coenzym A wird mittels eines im Zellrohsaft vorhandenen Enzyms,insbesondere einer Dehydrogenase, Ligase oder einer Transacetylaseunter Verwendung eines Acetylgruppendonors wieder zu Acetyl-CoRumgesetzt. Damit steht das Acetyl-CoA für eine erneute Umsetzung von 10-DABzu Baccatin III zur Verfügung,so dass Baccatin III kontinuierlich hergestellt werden kann.
    [0052] Dievorliegende Erfindung wird durch das nachfolgende Beispiel näher beschrieben.
    [0053] AlleSchritte werden bei 4 °Cdurchgeführt. 7,5g Feuchtbiomasse von Escherichia coli des Stammes JM 109 rec– desKlones pZP1, die zuvor bei –21°C gelagertwurden, wird in einem 50 mM Phosphatpuffer (KH2PO4: 0, 434 g/l, Na2HPO4·2H2O: 8,33 g/l, pH = 7,8) zu einem Gesamtvolumenvon 20 ml resuspendiert. Die so erhaltene Suspension wird in einemEdelstahlaufschlussgefäß mittelsUltraschall (Ultraschallprozessor Dr. Hielcher, Typ UP 400 s) 2 minaufgeschlossen (Amplitide 70 %, Zyklus 0,3). Der erhaltene Zellsaftwird unter Zugabe von 30 μlDNase (90 Units, AppliChem) eine Stunde auf Eis gerührt. Anschließend wirdder Zellsaft in ein 50 ml Falconröhrchen überführt und abzentrifugiert (HettichZentrifuge, Typ Rotanta 46 R, 3500 U/min, Temperatur 4 °C). Der erhaltene Überstandwird mit einer Polyethylenimin-Lösung(Endkonzentration 0,5 %, Serva) gefällt und verbleibt 30 Minutengerührtauf Eis. Dann wird der Zellsaft 30 min abzentrifugiert und der Überstandmit 20 % Glycerin versetzt. Die so erhaltenen Flüssigkeit stellt den Zellrohsaftdar.
    [0054] Dieenzymatische Reaktion erfolgt in einem Enzymmembranreak tor (HohlfasermodulMiniKros® SamplerPS, Gehäusegröße 2, Trenngrenze10 kD, Fläche615 cm2, membraPure) unter folgenden Bedingungen: AlsLösungsmittelkommt Diisopropylether (Riedel-deHaën) zum Einsatz. 750 ml werdenin eine 1l-Schottflasche abgefülltund im Wasserbad auf 13 °Ctemperiert. 150 ml Zellrohsaft werden in eine 250 ml-Schottflasche überführt undmit 60 μg10-DAB (Deacetylbaccatin-III, Coral Drugs), welches in 2 ml Ethanolgelöstwurde, sowie 60 mg Glucose-Monohydrat (Fluka) versetzt und im Wasserbadbei 13 °C temperiert.Die Diisopropylether-Phase wird mit Hilfe einer Membranpumpe (TypDosierpumpe DME, Telab) mantelseitig mit einem Fluss von 985 ml/hgepumpt. Eine Schlauchpumpe (Typ: BV-GES, Ismatec) zirkuliert denZellrohsaft mit einem Volumenstrom von 984 ml/h durch die Hohlfaser.Es wird kein Überdruckangelegt. Ein Durchbruch einer der beiden Phasen über dengesamten Versuchszeitraum wurde nicht beobachtet.
    [0055] Dasgebildete Baccatin III wird kontinuierlich extraktiv aus der wässrigenPhase abgezogen und reichert sich in der Diisopropylether-Phasean. Ein Auswaschen des Substrates 10-DAB durch die organische Phasewird durch die Selektivitätdes verwendeten Lösungsmittelsverhindert. Das Produkt Baccatin III wird durch Einrotieren derLösungsmittelphasein einem Vakuumrotationsverdampfer nach Ablauf der enzymatischenReaktion erhalten. Das so erhaltene Produkt Baccatin III besitzteine Reinheit von 97 %. Unter den genannten Bedingungen ergibt sichein Umsatz von bis zu 70 %. Als Versuchsdauer sind mindestens 24Stunden anzusetzen.
    权利要求:
    Claims (17)
    [1] Vorrichtung zur enzymatischen Herstellung vonBaccatin III aus 10-Deacetylbaccatin in einem Enzymreaktor, dadurchgekennzeichnet, dass der Enzymreaktor eine Hohlfaser-Ultrafiltrationsmembran(M) aufweist, wobei im Innern des Enzymreaktors eine Acetyltransferaseaus Taxus spec. immobilisiert ist.
    [2] Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,dass die Hohlfaser-Ultrafiltrationsmembran (M) Polysulfon und/oderPolyethersulfon aufweist.
    [3] Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,dass die Hohlfaser-Ultrafiltrationsmembran (M) eine Porengrößenverteilungvon kleiner 10 nm oder eine Trenngrenze von kleiner 50 kD aufweist.
    [4] Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,dass die Hohlfaser-Ultrafiltrationsmembran (M) eine Porengrößenverteilungvon kleiner/gleich 3 nm oder eine Trenngrenze von kleiner/gleich10 kD aufweist.
    [5] Verfahren zur enzymatischen Herstellung von BaccatinIII aus 10-Deacetylbaccatin III (10-DAB), insbesondere in einemEnzymreaktor, dadurch gekennzeichnet, dass das 10-DAB in einem Flüssigphasensystem,mit einer wässrigen Phase(A) und einer organischen Phase (B), mittels eines eine Acetyltransferaseaus Taxus spec. enthaltenden Zellrohsafts zu Baccatin III umgesetztwird.
    [6] Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,dass als wässrigePhase (A) ein wässriger Puffer,insbesondere ein Phosphat- und/oder MOPS-Puffer eingesetzt wird.
    [7] Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet,dass als organische Phase (B) ein nicht-halogenierter Ether, insbesondereDiisopropylether oder Dibutylether eingesetzt wird.
    [8] Verfahren nach mindestens einem der Anspruch 5 bis7, dadurch gekennzeichnet, dass die Acetyltransferase im Enzymreaktor(R) in der wässrigenPhase (A) immobilisiert ist.
    [9] Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 5 bis8, dadurch gekennzeichnet, dass eine Hohlfaser-Ultrafiltrationsmembran(M) die organische Phase (B) von der wässrigen Phase (A) trennt.
    [10] Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,dass die Hohlfaser-Ultrafiltrationsmembran (M) hydrophob ist.
    [11] Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet,dass die Hohlfaser-Ultrafiltrationsmembran (M) Polysulfon und/oderPolyethersulfon aufweist.
    [12] Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 8 bis10, dadurch gekennzeichnet, dass die Hohlfaser-Ultrafiltrationsmembran(M) eine Porengrößenverteilungvon kleiner 10 nm oder eine Trenngrenze von kleiner 50 kD aufweist.
    [13] Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 8 bis10, dadurch gekennzeichnet, dass die Hohlfaser-Ultrafiltrationsmembran(M) eine Porengrößenverteilungvon kleiner/gleich 3 nm oder eine Trenngrenze von kleiner/gleich10 kD aufweist.
    [14] Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 5 bis13, dadurch gekennzeichnet, dass der wässrigen Phase (A) zur Regenerierungdes durch die Umsetzung von 10-DAB zu Baccatin III verbrauchtenAcetyl-Coenzyms A der wässrigenPhase (A) Glucose und/oder Pyruvat zugesetzt wird.
    [15] Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 5 bis14, dadurch gekennzeichnet, dass der Zellrohsaft aus Escherichiacoli und/oder Pichia pastoris und/oder Spalthefen gewonnen wird.
    [16] Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 5 bis15, dadurch gekennzeichnet, dass der Zellrohsaft durch Fällung miteiner Polyethylenimin-Lösunghergestellt wird.
    [17] Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 5 bis16, dadurch gekennzeichnet, dass das 10-DAB aus Eibennadeln gewonnenwird.
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    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    2005-08-04| OP8| Request for examination as to paragraph 44 patent law|
    2007-11-29| 8364| No opposition during term of opposition|
    2010-08-26| 8327| Change in the person/name/address of the patent owner|Owner name: FRENSE, DIETER, DR., 37308 HEILBAD HEILIGENSTA, DE |
    2011-04-14| 8330| Complete disclaimer|
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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    PCT/DE2005/000017| WO2005066353A1|2004-01-09|2005-01-10|Vorrichtung und verfahren zur enzymatischen herstellung von baccatin iii|
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